儲存和使用期：2-8°C

應用：用于定性檢測人血清，血漿，細胞培養(yǎng)上清液或任何生物液體中的YFV-IgM。

介紹

黃熱病，稱為黃色杰克，黃色瘟疫或青銅約翰，是一種急性病毒性疾病。在大多數(shù)情況下，癥狀包括發(fā)熱，寒戰(zhàn)，食欲不振，特別是在背部的肌肉痛，和頭痛。癥狀通常在五天內改善。在一些人在一天內改善，發(fā)燒回來，腹痛發(fā)生，肝損傷開始導致黃色皮膚。如果發(fā)生這種情況，出血和腎臟問題的風險也增加。

測定原理

96孔板YFV-IgM特異性抗原。將對照或測試樣品加入到合適的孔中并孵育。用洗滌緩沖液洗去游離組分。將HRP綴合的檢測試劑加入到孔中。 TMB底物用于顯現(xiàn)HRP酶反應。 TMB由HRP催化以產生在加入酸性停止溶液后變?yōu)辄S色的藍色產物。黃色的密度與板中捕獲的樣品的YFV-IgM量成比例。外徑在微板讀數(shù)器中在450nm下通過分光亮度計測量吸亮度，然后可以計算YFV-IgM的濃度。

套件組件

1.       一個96孔板預涂

2.       陽性對照：0.5ml

3.       陰性對照：0.5ml

4.       洗滌緩沖液（30×）：20 ml。稀釋：1:30

5.       樣品稀釋緩沖液：6ml

6.       6HRP酶聯(lián)試劑（RTU）：6ml

7.       終止液：6ml

8.       TMB底物：6ml

9.       TMB底物B：6ml

10.   板密封：2

11.   密封袋：1

需要材料但不提供

1.37℃培養(yǎng)箱

2.酶標儀（波長：450nm）

3.精確的移液器和一次性移液器吸頭

4.自動洗板機

5.ELISA振蕩器

1.5ml管

7.板蓋

8.吸收濾紙

9.100ml和1L體積量筒。

使用程序:

A.制備樣品和試劑

1. 樣品

收集并立即分析測試樣品（2小時內）后立即分離。或等分并長期儲存在-20°C。避免多個凍融循環(huán)。

?細胞培養(yǎng)上清：以約2000-3000×rpm離心20分鐘，以去除沉淀，立即分析或分裝，并儲存于-20℃。

?血清：在室溫下凝結血清（約4小時）。以約2000-3000×rpm離心20分鐘。立即分析血清或等分，并儲存在-20°C。

?血漿：用檸檬酸鹽或EDTA作為抗凝劑收集血漿。在收集30分鐘內以2000-3000×rpm離心20分鐘。立即分析或等分，并存儲在-20°C冷凍。

尿：在無菌容器中收集，以2000-3000×rpm離心20分鐘。立即分析或等分，并存儲在-20°C冷凍。

組織：組織勻漿的制備將根據組織類型而變化。收集和沖洗樣品在2-4℃下用PBS（Ph 7.4）。稱重樣品并用PBS（Ph 7.4）勻化，并對細胞懸浮液進行超聲處理。以2000-3000×rpm離心20分鐘。立即測定或等分并儲存在-80℃。

注意：

1.凝結血液樣品，離心，避免溶血和沈淀。

2.NaN3不能用作試驗樣品防腐劑，因為它抑制HRP。

2.洗滌緩沖液

用蒸餾水稀釋濃縮洗滌緩沖液30倍（1/30）（即將20ml濃縮洗滌緩沖液加入580ml蒸餾水中）。

B.測定程序

在使用前將試劑盒組分和樣品平衡至室溫。建議繪制每個測試的標準曲線。

1.在預涂板上分別設置陽性/陰性，測試樣品和對照（零）孔，并記錄它們的位置。

2.將50μl的陰性和陽性對照等分到設定的孔中。

3.向對照（零）孔中加入50μl樣品稀釋緩沖液。

4.向測試樣品孔中加入50μl適當稀釋的樣品。在底部加入溶液而不接觸側壁。搖動平板以混合內容物。

5.用蓋子密封板，并在37℃孵育30分鐘。

6.取下蓋子并通過在吸收性濾紙或其他吸收材料上敲擊板來丟棄板內容物。

7.棄去溶液，用洗滌緩沖液洗滌板5次。不要讓孔在任何時候干燥。

手動清洗：丟棄溶液，不要接觸側壁。將吸水濾紙或其他吸收材料上拍出液體。將洗滌緩沖液填滿每個孔，并在ELISA振蕩器上輕輕渦流2 分鐘。丟棄內容物，并將吸收性濾紙或其他吸收材料上的板敲打。洗板五次。

自動洗滌：棄去所有孔中的溶液，并用洗滌緩沖液洗滌板5次（用緩沖液過量填滿孔）。在最后的洗滌之后，翻轉該板并敲擊吸收性濾紙或其它吸收材料。建議將清洗器設置為1分鐘的浸泡時間。

8.向每個孔中加入50μlHRP結合物的試劑（對照孔除外）。在每個孔底部加入溶液，不要接觸側壁。

9.用蓋子密封板，并在37℃孵育30分鐘。

10.取下蓋子，用洗滌緩沖液洗板5次。

11.向每個孔中加入50μlTMB底物A和50μlTMB底物B，蓋上平板并在37℃下孵育15分鐘。避免暴露于光。

12.向每個孔中加入50μl終止液，充分混勻。顏色應立即變?yōu)辄S色。

13.閱讀O.D.在微板讀數(shù)器中在450nm的吸亮度在加入終止溶液的15分鐘內。對于計算，（相對O.D.450）=（每個孔的O.D.450） - （零阱的O.D.450）。標準曲線可以作為每種標準溶液（Y）的相對O.D.450與標準溶液（X）的相應濃度作圖。可以從標準曲線插入樣品的人類YFV-IgM濃度。

14.注意：如果稀釋樣品，稀釋倍數(shù)乘以內插法得到稀釋前的濃度。

C.結果確定

1.試驗有效性：陽性對照的平均值≥1.00; 陰性對照的平均值≤0.10。

2.臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=負控制的平均值+0.15

3.陰性結果：如果OD值<CUT OFF，樣品為人YFV-IgM陰性。

4.陽性結果：如果OD值≥CUTOFF，樣品為人類YFV-IgM陽性。

D.注意事項

1.在實驗之前，離心每個試劑盒組分數(shù)分鐘，將所有試劑倒入試管底部。

2.在混合或重新組裝部件時避免起泡或氣泡。

3.洗滌緩沖液可結晶并分離。如果發(fā)生這種情況，請加熱管以溶解。

4.建議每個對照和樣品一式兩份或重復測量三次。

5.不要讓板在任何時候干燥！這可以使板上的生物材料失活。

6.不要重復使用移液器吸頭和管，以避免交叉污染。

7.不要使用不同套件中過期的組件或組件。

8.將TMB底物B儲存在黑暗中，并且為了避免板溫育對于溫度差的邊緣效應，建議在使用前在室溫下使TMB底物平衡30分鐘。用滅菌的吸頭抽吸所需的劑量，不要將殘留溶液倒回到小瓶中。